大鼠饥饿中依赖嗅觉的探索行为及神经机制_论文精选_好文学网

大鼠饥饿中依赖嗅觉的探索行为及神经机制

我们如何得知自己所处的精确位置?为什么我们能够准确地从一个地点到达另一个地点?我们的大脑怎样学习并记忆所需的路线信息?这些问题的答案还要从2014年的诺贝尔生理学与医学奖说起。当年的奖项颁给了三位神经生理学家—— 约翰·奥基弗(John O`keefe)、梅-布里特·莫泽(May-Britt Moser))和爱德华·莫泽(Edvard Moser),以表彰他们在发现大脑中的定位系统方面所做的贡献。

时间:2016-09-04 20:54点击: 次来源:好文学作者:佚名评论:- 小 + 大

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摄食行为是动物基本也重要的行为方式,啮齿类动物通过嗅觉系统,完成食物的搜索,嗅觉系统对啮齿类动物的生存至关重要,下面是小编搜集整理的一篇探究饥饿嗅觉探索行为神经机制的论文范文,欢迎阅读查看。

关于学习和记忆,大脑中还隐藏着有很多未解的秘密。图片来源:123RF

饥饿可以定义为驱动个体寻找和消化食物的感觉或动力[1].摄食及觅食行为是动物的基本行为,以嗅觉系统为导向是啮齿类动物觅食的重要特点,嗅觉系统的基本构成包括位于嗅粘膜上的感觉神经元,大脑前端的嗅球,以及嗅皮层,嗅皮层中关键部分为梨状皮层[2].感觉神经元及嗅球主要的功能是对不同的气味分子进行识别,并形成精确的空间定位[3].嗅皮层主要完成对嗅觉信号的整合,形成嗅觉记忆,并把特定嗅觉信号和其他诸如颜色、味道、形状、空间位置等感觉信息进行整合[4].

大脑中的这套“内置GPS”系统由位于内嗅皮层(Entorhinal cortex, EC)的网格细胞(grid cell),位于海马(Hippocampus)的位置细胞(place cell),以及附近的一些其他功能细胞构成。这套系统的作用,是确定身体的空间位置,并使我们能够利用这些信息,在复杂的环境中准确地规划路线,进行导航。当动物或人类进入某一个新环境后,这套系统便会不断地重复学习和记忆的过程,持续更新和巩固对于新环境空间信息的了解与掌控。

动机的形成有先天遗传,也有后天的经验和学习,但均依赖于脑内特定的神经环路及递质系统[5].动物的觅食动机和其饥饿状态密切相关,饥饿状态下动物的觅食动机增强,反应在嗅觉系统对食物发出的气味分子更加敏感,探索行为更加强烈[6].但对于饥饿状态下,动物觅食行为的反应和梨状皮层的关系尚不清楚。本实验以大鼠为研究对象,利用食物埋藏,观察大鼠饥饿状态下依赖嗅觉的探索行为的变化,在此基础上,利用荧光金标记技术观察嗅球到梨状皮层的投射变化,利用c-fos标记技术研究梨状皮层神经元活化水平。

诺奖解决了前两个问题,然而我们的大脑怎样学习并记忆信息还是个谜团。绝大多数科学家认为大脑中的海马系统和相关皮质对于空间导航、学习以及记忆的形成非常重要。如果对海马造成直接损伤,或者破坏海马与相关大脑皮层(例如内嗅皮层)之间的输入-输出的联系,将会造成很严重的学习记忆障碍。

一、材料和方法

根据细胞形态及皮质发育的差异,海马被分为CA1、CA2、CA3、CA4四个扇形区。来自多个感觉器官的信息经过一系列脑区的初步加工后,主要通过内嗅皮层传递到海马进行更进一步的加工与存储。以往的研究显示,内嗅皮层与海马之间的信息交换主要通过一长一短两条通路完成。长的叫做非直接突触传入通路(简称“长程间接通路”),信息的传递路径为:内嗅皮层结构中的第二层→海马齿状回→CA3→CA1;短的叫做直接突触传入通路(简称“短程直接通路”),信息直接从内嗅皮层结构中的第三层传递到海马CA1。 长程间接通路在学习与记忆的过程中十分重要。大量实验研究也已经揭示了长程间接通路神经元之间的突触分布状况。但人们对短程直接通路的功能角色与突触连接图谱却知之甚少。研究者在尝试理解内嗅皮层的作用时发现,内嗅皮层中的不同区域所加工的内容存在着很大的差别。内嗅皮层区域的内侧(MEC)所包含的神经细胞会对与空间信息比较敏感,而内嗅皮层外层区域外侧(LEC)的神经细胞则会对非空间信息(气味、颜色等)比较敏感。可是,内、外侧的内嗅皮层神经细胞,在短程直接通路中的突触连接,以及参与学习记忆功能的机理等方面是否存在显著的差别,还没有明确的结论。

雄性SD大鼠16只,体重250~300g,由兰州大学基础医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。脑立体定位仪、冰冻切片机、抗c-fos一抗、荧光显微镜、偶联cy3二抗.

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2.1动物和分组雄性SD大鼠16只,安静环境饲养,12小时光照周期,温度22~25℃,湿度65~75%之间,自由摄食饮水。16只大鼠随机分成2组:禁食组,正常组,每组8只,禁食组大鼠禁食48h,正常对照组给予正常饮食。

内外侧内嗅皮层与海马之间的连接示意图(长程通路、短程通路)。图片来源:作者改编自Guilherme Neves etal., 2012

2.2嗅球置管大鼠用7%的水合氯醛腹腔麻醉,俯卧位,固定在立体定位仪上,头部正中切口,剥离骨膜,使前后囟位于同一水平面。参照大鼠脑图谱,将长4.1cm、内径0.3mm、外径0.4mm的不锈钢带内芯套管植入大鼠左侧嗅球(anteri-ortobregmaat7.7mm;laterialfrommidlineat1.6mm;deepfromskuat5mm),牙科水泥结合螺钉固定套管,旋紧套管帽,术后1周,创伤完全恢复,开始实验。

最近,北京师范大学脑与认知科学研究院、认知神经科学与学习国家重点实验室的章晓辉研究团队在《自然·神经科学》杂志上发表的一篇封面文章,从细胞组成、突触连接、神经元电活动和学习行为四个层面,给出了一些明确的结论。

2.3清醒状态下的荧光金注射禁食组连续禁食48h后,大鼠头部固定,利用微量注射泵经套管注射10%的荧光黄2μl,注射结束,旋紧套管帽。立即置于大鼠食物埋藏箱,并记录大鼠找到全部食物的总时间。

研究团队在海马区域记录到354个神经细胞,并对其进行了神经形态学重构。结果发现,海马的CA1的背侧区域内确实存在不同形态的神经细胞群体。这与前人的研究结果相吻合——根据对神经元外观形态上的不同,海马区域内的神经细胞群体可以分成两类:一类是简单锥体细胞,另一类是复杂锥体细胞。

2.4埋藏食粒法评价大鼠的嗅觉探索行为食物埋藏箱用正方形透明塑料盒制成(45cm×20cm×20cm),底部铺5cm厚度的颗粒垫料,垫料经消毒处理,和前期所用垫料相同。食物颗粒埋藏在大约1cm深处,位置如Fig.1A所示:共放置4枚食物,记录找到4枚食粒的总时间。嗅觉探索行为结束后6h,立即处死动物。

进一步的研究发现,海马CA1区域中的这两种锥体细胞在短程直接通路中,与内、外侧内嗅皮层神经细胞的突触连接也存在着显著的差别——简单锥体细胞只能与内侧的内嗅皮层(MEC)神经细胞形成直连接,而复杂锥体细胞既可以与内侧的内嗅皮层(MEC)神经细胞形成连接,也可以与外侧的内嗅皮层(LEC)神经细胞形成连接。换言之,海马CA1背侧区域的复杂锥体细胞可以接受两类信息(空间信息、非空间信息)的输入,而简单锥体细胞很有可能只接受空间信息的输入。可以这么理解:当人身处花园的时候,CA1背侧区域的复杂锥体细胞既知道人在花园里这个位置,还知道花园里的花香;而简单锥体细胞很可能就只知道人在花园里而已。

2.5全脑固定与切片嗅觉探索结束后6h,全部大鼠用7%的水合氯醛腹腔麻醉,打开胸腔,用250ml生理盐水经左心室快速灌注冲洗,再用4%多聚甲醛250ml灌注固定,立即开颅取脑,置人固定液4℃下过夜,再转入20%蔗糖溶液4℃下放置,待沉底后,再移入30%蔗糖溶液4℃下放置,待沉底后,连续冠状冰冻切片,片厚30μm,放置于冷冻保护液内,-20℃保存备用。

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2.6c-fos免疫荧光组织化学技术分析梨状皮层神经元活化水平根据大鼠脑图谱,界定梨状皮层位置,如Fig.1B所示。选取6张梨状皮层平面,分别位于Bregma1.92mm,1.56mm,1.2mm,0.84mm,0.48mm,和0.12mm,相邻切片之间距离为360μm.利用漂片法进行c-fos的免疫荧光染色,根据常规免疫荧光方法,抗c-fos一抗,4℃,孵育24h,漂洗,偶联cy3的二抗,室温下避光孵育1h,漂洗,贴片,甘油封片,荧光显微镜观察。

简单细胞与复杂细胞在通路中的连接分布示意图。图片来源:章晓辉团队

2.7荧光显微镜观察FG及C-fos阳性神经元在梨状皮层的分布完成c-fos免疫荧光染色的脑片置于荧光显微镜下,首先用530nm的激发光显示cy3,在左侧梨状皮层拍照,位置不变,转换到紫外光,显示FG,并拍照。每张脑切片在左侧梨状皮层,20倍物镜下拍两个视野。

为了能够弄清短程直接通路中,内外侧内嗅皮层神经细胞在关联学习行为中的作用,找到大脑中神经通路与行为之间的因果联系,研究者对实验用的小鼠使用了光遗传学(Optogenetics)技术。光遗传学是一项神经调控技术。通过这个技术,研究人员可以用基因工程的手段让神经细胞产生视蛋白,然后就可以用光来操作神经细胞的活动特性。打个比方,假设我们大脑中的某一个特定的部分负责控制人的睡眠,那么我们就可以利用光学遗传技术对这个特定的部位进行控制,实现类似于“用蓝光照就睡不着觉;用红光照立马就睡着”的效果。是不是很炫酷!

2.8细胞计数方法采用盲法计数,分别计数每个视野下c-fos阳性细胞,FG阳性细胞,以及c-fos和FG双阳性细胞。每只动物计数6张脑片,12个视野,后用每个视野的均值代表阳性细胞的数量。统计学处理:全部数据用均数±标准差表示,组内比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析。数据处理用SPSS17.0version的统计软件进行,P<0.05表示差异具有显着性。

章晓辉团队通过光学遗传技术有选择性地分别抑制了外侧内嗅皮层(3层)→海马的CA1的背侧区,内侧内嗅皮层(3层)→海马的CA1的背侧区,以及内嗅皮层2层→海马齿状回(长程间接通路)三种神经环路的活动(参见图2)。实验结果发现,只有抑制外侧内嗅皮层(3层)→海马的CA1的背侧区这一短程连接通路的神经活动才能显著地影响动物的学习行为。既然这一短程连接通路能够参与学习行为,那在学习的过程中,海马的CA1背侧区的锥体细胞又会发生怎样的变化呢?为了回答这个问题,研究团队又利用载体光电极神经,记录了学习过程中,海马CA1背侧区的锥体细胞的放电活动。结果发现,相较于邻近的神经细胞而言,CA1区域的复杂锥体细胞对学习中的不同气味线索有更明显的偏好。这说明外侧内嗅皮层(3层)→海马的CA1的背侧区这一特异的神经通路与学习记忆之间可能存在着因果联系。同时,研究者也研究了正在探索“U”型迷宫的小鼠的电生理状况。研究表明,CA1这两类复杂和简单锥体细胞都可以是位置细胞,都可以编码相同量空间信息。这与在检测短程直接通路的连接图谱中所发现的CA1复杂和简单锥体细胞都接受内侧内嗅皮层的输入的结果一致。

二、结果

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1饥饿对嗅探索行为的促进作用

外侧内嗅皮层(3层)→海马的CA1的背侧区的光遗传学操作显著地影响小鼠学习行为。

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